超分辨高精度顯微鏡3D成像模塊

光學(xué)顯微鏡憑借其非接觸、無損傷等優(yōu)點(diǎn)，成為生物學(xué)家研究細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)、蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、DNA等遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器以及膜結(jié)構(gòu)等應(yīng)用不可少的工具，然而衍射極限的存在，使得人們無法清晰地觀察到橫向尺寸小于200nm、軸向尺寸小于500nm的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。二十一世紀(jì)初期，具有納米尺度分辨率的超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)的出現(xiàn)，使得研究人員可以在更高的分辨率水平進(jìn)行生物研究。在超分辨顯微技術(shù)飛速發(fā)展的同時(shí)，現(xiàn)有成像技術(shù)的缺陷也日益顯現(xiàn)，例如成像分辨率和成像時(shí)間不可兼得；對透鏡制造技術(shù)提出了一定要求的同時(shí)，也限制了觀測的視野；日益復(fù)雜的設(shè)備使得操作和維護(hù)也越來越困難等。

為解決上述問題,美國Double Helix Optics公司提出了納米級(jí)分辨率成像的新概念-“SPINDLE"，不僅突破了衍射極限，還可以實(shí)現(xiàn)三維成像，可捕捉到小至橫向尺寸10 nm、軸向尺寸15 nm的細(xì)節(jié)。在該技術(shù)中，SPINDLE模塊被安裝在顯微鏡和ccd或相機(jī)之間，無需改變現(xiàn)有成像系統(tǒng)設(shè)置。基于特殊設(shè)計(jì)的相位掩模版，從工程化點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) (E-PSF)出發(fā)，使用螺旋相位掩模板來控制景深、發(fā)射波長和精度，結(jié)合3DTRAX軟件對3D圖像進(jìn)行重建和分析，可在不需要掃描的條件下即時(shí)捕獲 3D 信息，得到深度和精度3D圖像，橫向精度可達(dá)20nm, 軸向精度可達(dá)25nm，成像深度可達(dá)20um。當(dāng)與其他工具和技術(shù)，包括STORM、PALM、SOFI、光片顯微、寬場、寬場顯微、TIRF、FRET等一起使用時(shí)，可釋放巨大的潛力，適用于活細(xì)胞、固定細(xì)胞和全細(xì)胞成像、單分子、粒子跟蹤和粒子計(jì)數(shù)等應(yīng)用。

圖1：SPINDLE2雙通道顯微鏡模塊，用于同時(shí)多色、多深度3D成像

SPINDLE2可以被很容易地安裝到現(xiàn)有顯微鏡和CCD或相機(jī)之間，內(nèi)置旁路模式可輕松返回到非3D光路，是實(shí)現(xiàn)單發(fā)超分辨和3D寬場成像的理想解決方案。

圖2：非洲綠猴腎細(xì)胞的3D 圖像，微管和肌動(dòng)蛋白分別標(biāo)記，兩種顏色同時(shí)成像

在SPINDLE模塊中，最核心的是經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)的相位掩模板，其尺寸和設(shè)計(jì)需和光學(xué)系統(tǒng)和成像條件相匹配。這些相位掩模板將單一物體發(fā)出的光分裂成兩個(gè)獨(dú)立的旋轉(zhuǎn)的光瓣，類似于雙螺旋。兩瓣的中點(diǎn)對應(yīng)物體發(fā)光源的橫向位置，兩瓣的夾角對應(yīng)發(fā)光源的軸向位置。由于旋轉(zhuǎn)180°時(shí)光斑可以保持聚焦，因此可以高精度地獲取發(fā)光“點(diǎn)"的深度信息。收集的數(shù)據(jù)由許多這些在不同方向上與物體橫向和軸向位置相對應(yīng)的分離良好的點(diǎn)組成。經(jīng)過對這些詳細(xì)的目標(biāo)點(diǎn)數(shù)據(jù)集處理和圖像重建創(chuàng)建，即可得到超高分辨率原始物體清晰的三維結(jié)構(gòu)。

圖3：工程化相位掩模板通過每幀成像更大的體積來節(jié)省時(shí)間和存儲(chǔ)空間，并降低感光度

豐富多樣的相位掩模板庫，包括雙螺旋，單螺旋，EDOF，四足，和多色設(shè)計(jì)以提供最大的控制和靈活性。用戶可依據(jù)深度范圍、波長和其他光學(xué)參數(shù)選擇合適的相位掩模版以滿足最佳的深度-精度平衡。

3DTRAX® 軟件用于計(jì)算每個(gè)粒子的z位置，運(yùn)行專有算法以自動(dòng)進(jìn)行3D定位，以?20 nm的深度和分辨率渲染高精度3D圖像，用于單分子定位和跟蹤。對漂移進(jìn)行自動(dòng)校正并生成直觀的繪圖，同時(shí)保持高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

圖4：3DTRAX®是非常易于使用的斐濟(jì)插件

使用適用于 Windows、MacOS 和 Linux 的庫集成到您的工作流程或 OEM 儀器中，以 ThunderSTORM 或雙螺旋文件格式保存圖像并導(dǎo)出文件以供進(jìn)一步分析，專有的反卷積算法可以在不損失精度的情況下重建全細(xì)胞圖像。

圖5：從左到右：非洲綠猴腎細(xì)胞的細(xì)胞骨架，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的微管，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞核中的復(fù)制DNA的3D超分辨圖像

超分辨顯微鏡3D成像模塊應(yīng)用

超分辨顯微成像和3D粒子跟蹤技術(shù)為生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究、藥物發(fā)現(xiàn)、材料科學(xué)研究和工業(yè)檢測打開了一個(gè)充滿可能性的新世界。雙螺旋工程技術(shù)具有高達(dá)傳統(tǒng)顯微鏡30倍的成像深度，其為超分辨成像帶來精度-深度平衡。在3D粒子追蹤應(yīng)用中，雙螺旋工程帶來的擴(kuò)展的深度可以實(shí)現(xiàn)更長粒子軌跡的捕獲。

在生命科學(xué)領(lǐng)域，雙螺旋光工程正在從癌癥和免疫學(xué)到傳染病和神經(jīng)科學(xué)的生命科學(xué)的突破。研究人員通過使用SPINDLE模塊發(fā)現(xiàn)了新的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞的相互作用。研究神經(jīng)退行性疾病的科學(xué)家們能夠看到以前從未見過的壓力顆粒核3D圖像。同樣，研究免疫學(xué)的研究人員已經(jīng)能夠重建整個(gè)T細(xì)胞。

在藥物開發(fā)領(lǐng)域，研究人員已經(jīng)可以看到和跟蹤藥物化合物的真正工作原理，而不是簡單地模擬新的化合物。雙螺旋光工程實(shí)現(xiàn)了在成像和單粒子跟蹤(SPT)領(lǐng)域的新突破，隨著追蹤分子的能力跨越更大的景深（高達(dá)20um），雙螺旋可以記錄比以往任何時(shí)候更長的軌跡，使得識(shí)別先導(dǎo)化合物和加快藥物發(fā)現(xiàn)變得更加容易。

在材料科學(xué)領(lǐng)域，借助3D納米成像和粒子跟蹤技術(shù)，無論是金屬、半導(dǎo)體、陶瓷、聚合物還是納米材料研究，雙螺旋技術(shù)都可以讓您看到材料的結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性等性能。精密成像與深度擴(kuò)展相結(jié)合，讓你對粒子動(dòng)力學(xué)有了新的認(rèn)識(shí)。有了更多的數(shù)據(jù)，就可以更好地預(yù)測材料在任何給定應(yīng)用領(lǐng)域中的性能。

在工業(yè)檢測領(lǐng)域，雙螺旋工程可實(shí)現(xiàn)納米尺度的三維檢查?，F(xiàn)在你可以在從微芯片到像素級(jí)的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)微小的缺陷和其他功能缺陷。納米級(jí)精度的檢測，可以提高質(zhì)量控制，節(jié)省時(shí)間，降低成本，提高產(chǎn)量和跟蹤質(zhì)量。

引文：[1]金錄嘉, 何洋, 瞿璐茜,等. 新型超分辨顯微技術(shù)的最新研究進(jìn)展[J]. 光電產(chǎn)品與資訊, 2018, 9(3).

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相關(guān)文獻(xiàn)：

(1)Anastasiia Misiura, et. al., “Single-Molecule Dynamics Reflect IgG Conformational Changes Associated with Ion-Exchange Chromatography," Analytical Chem., 2021

(2)Laura Hoppe Alvarez, et. al., “Controlling microgel deformation via deposition method and surface functionalization of solid supports,"

Phys. Chem. Chem. Phys., 2021,23, 4927-4934

(3)Xilin Yang, et. al., “Deep-Learning-Based Virtual Refocusing of Images Using an Engineered Point-Spread Function," ACS Photonics, 8, 7, 2174–2182, June 2021

(4)Anish R. Roy, et. al., “Exploring cell surface-nanopillar interactions with 3D super-resolution microscopy," BioRxiv, June 2021S. Li, J. Wu, H. Li, D. Lin, B. Yu, and J. Qu, “Rapid 3D image scanning microscopy with multi-spot excitation and double-helix point spread function detection," Optics Express, vol. 26, no. 18, p. 23585, 2018.

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